Sterilisasi merupakan proses penting dalam kegiatan laboratorium mikrobiologi maupun pelayanan kesehatan untuk memusnahkan semua bentuk kehidupan mikroorganisme, termasuk spora. Autoklaf (alat sterilisasi uap bertekanan) adalah metode yang paling umum dan efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas, media kultur, dan instrumen yang tahan panas. Praktikum ini bertujuan untuk memahami prinsip kerja, prosedur operasional, serta verifikasi efektivitas autoklaf dalam mencapai kondisi steril.
Prinsip dasar autoklaf bekerja berdasarkan uap air jenuh bertekanan tinggi. Pada tekanan 1 atmosfer di atas tekanan normal (sekitar 15 psi), suhu uap air dapat mencapai 121°C. Suhu tinggi dan kelembaban ini mampu mendenaturasi protein dan menghancurkan struktur sel mikroorganisme secara lebih cepat dan efektif dibandingkan sterilisasi kering (oven).
Alat-alat yang akan disterilkan (pinset, tabung reaksi, Erlenmeyer) dibersihkan terlebih dahulu secara mekanis. Untuk alat yang sensitif terhadap kontak langsung dengan uap, seperti pipet atau alat bedah, perlu dibungkus dengan kertas khusus atau aluminium foil. Media kultur cair dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditutup longgar menggunakan kapas berlapis aluminium foil.
Alat-alat atau media diletakkan di dalam autoklaf dengan memperhatikan beberapa hal krusial. Penting untuk tidak mengisi autoklaf terlalu penuh agar sirkulasi uap merata. Cairan tidak boleh lebih dari 2/3 volume wadah untuk menghindari luapan saat mendidih. Kertas pembungkus tidak boleh menyentuh dinding dalam autoklaf.
Setelah autoklaf ditutup rapat, proses dijalankan. Siklus sterilisasi standar yang umum digunakan adalah pemanasan pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi selama 15 hingga 20 menit. Durasi ini ditentukan berdasarkan volume dan jenis beban yang disterilkan. Proses ini terdiri dari tiga fase utama: pemanasan (menghilangkan udara), tahap sterilisasi, dan pendinginan (pelepasan tekanan).
Setelah siklus selesai, tekanan dibiarkan turun secara perlahan (exhaust terkontrol) untuk mencegah pecahnya wadah kaca atau media yang mengandung cairan. Setelah tekanan mencapai nol dan suhu turun, pintu autoklaf dapat dibuka dengan hati-hati.
Untuk memverifikasi keberhasilan sterilisasi, digunakan indikator. Indikator kimia (strip label yang berubah warna pada suhu tertentu) menunjukkan bahwa suhu yang diinginkan telah tercapai. Sementara itu, indikator biologi, yang mengandung spora bakteri termofilik seperti Geobacillus stearothermophilus, adalah standar emas. Jika spora mati setelah sterilisasi, maka alat dinyatakan steril.
Dalam praktikum ini, indikator kimia menunjukkan perubahan warna sesuai spesifikasi, menandakan tercapainya suhu 121°C. Namun, keberhasilan sterilisasi tidak hanya bergantung pada suhu, tetapi juga pada penetrasi uap yang merata. Hambatan terbesar dalam sterilisasi autoklaf adalah adanya kantung udara yang terperangkap dalam wadah atau tumpukan alat yang terlalu padat, yang dapat menyebabkan "cold spot" atau area di mana mikroorganisme masih bertahan hidup. Oleh karena itu, teknik pengemasan dan penataan yang benar sangat vital untuk efektivitas metode ini.
Sterilisasi menggunakan autoklaf adalah metode sterilisasi basah yang sangat andal untuk menonaktifkan mikroorganisme, termasuk spora, pada suhu 121°C di bawah tekanan. Keberhasilan sterilisasi sangat dipengaruhi oleh persiapan pra-sterilisasi yang cermat, termasuk penataan alat yang tidak padat dan penggunaan indikator yang tepat untuk memantau kondisi operasional mesin. Pemahaman mendalam mengenai SOP autoklaf menjamin keamanan sampel dan hasil penelitian yang valid.